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如何從培養(yǎng)細胞中制備細胞核基質/中間纖維骨架結構？

發(fā)布時間： 2021-11-18　　點擊次數(shù)： 1396次

材料與儀器
細胞
Tritron X-100 抽提緩沖液
電子顯微鏡
步驟
1. 在 4℃ 用 PBS 洗細胞一次。

2. 在 4℃ 用含 0.5% Tritron X-100 的細胞骨架緩沖液抽提細胞 3 到 5 分鐘。直到消化步驟，每 107 個細胞最少要用 1 ml 緩沖液，以后減半。

3. 在 4℃ 用抽提緩沖液抽提細胞 3~5 分鐘。這一步去除組蛋白 H1 和除中間纖維蛋白之外的細胞骨架蛋白。另外，這一步也可在 DNA 酶消化步驟（第 4 步）之后作，這樣也不會引起超微結構的變化。

抽提緩沖液：

10 mmol/L PIPES，pH 6.8

250 mmol/L 硫酸銨

300 mmol/L 蔗糖

3 mmol/L MgCl2

1 mmol/L EDTA

4. 在含 0.5% Triton X-100 的消化緩沖液中用無 RNA 酶的 DNA 酶消化以去除染色質 DNA 酶濃度為 200~400 單位/ml，32℃ 反應 30~50 分鐘。

含 0.5% Triton X-100 的消化緩沖液：

10 mmol/L PIPES，pH 6.8

300 mmol/L 蔗糖

50 mmol/L NaCl

3 mmol/L MgCl2

1 mmol/L EGTA

5. 用抽提緩沖液清洗樣品兩次，每次 5 分鐘。

6. （可選）樣品在 4℃ 用 2 mol/L NaCl 抽提 3~5 分鐘。這一步能使可能形成核基質核心的 10 nm 纖絲分支顯形（Jackson and Cook 1988; He et al, 1990)。在第 4 步中用 Hae Ⅲ 和 Pst Ⅰ（每種酶 400 單位/ml）代替 DNA 酶 Ⅰ 可以使核心纖絲保存的更好。

2 mol/L NaCl 緩沖液：

10 mmol/L PIPES，pH 6.8

300 mmol/L 蔗糖

2 mol/L NaCl

3 mmol/L MgCl2

1 mmol/L EGTA

7. 固定核基質以進行免疫熒光檢測或電子顯微鏡檢測。

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